단백질 상호작용의 SILAC 실험 프로그램

MS를 식별하고 단백질 정량을 분석하는 것은 특정 결합 단백질 미끼를 판단하는 이 기술의 주요 이론입니다. 실험군과 대조군의 특정 단백질 함량이 통계적 차이에 도달하면 미끼 단백질이 단백질과 상호 작용한다는 것을 확신할 수 있습니다 혈압계.

프로그램 1

정상 세포주를 실험 재료로 사용합니다.

1. 경쇄 아미노와 중쇄 아미노를 각각 가지고 세포를 배양한다. 5세대와 6세대로 배양할 때 같은 양의 세포를 혼합하고 단백질도 추출해야 한다.

2. 경쇄 및 중쇄 단백질을 추출하여 정상 IgG 및 항미끼 단백질의 특정 항체의 도움을 받아 IP 기술로 처리합니다.

3. 경쇄 및 중쇄 단백질의 IP 생성물을 혼합한 후 SDS-PAGE 기술로 분리합니다.

4. 플라스틱 내부 소화, 펩타이드 추출, 정제, 식별 및 정량화.

프로그램 2

과잉 발현 미끼 단백질 세포주를 실험 재료로 사용합니다.

1. 정상세포의 세포주(라벨 있음)와 경쇄 및 중쇄 아미노산을 과발현한 미끼 단백질을 배양합니다. 5세대 및 6세대로 배양할 때 동일한 양의 세포를 혼합하여 단백질을 추출할 수 있습니다.

2. 추출된 총 단백질 세포의 경쇄와 중쇄는 태그 단백질 항체의 도움으로 IP로 처리되어야 합니다.

3. 경쇄 및 중쇄 단백질의 IP 생성물을 섞은 후 SDS-PAGE로 bw 분리합니다.

4. 플라스틱 내부 소화, 펩타이드 추출, 정제, 식별 및 정량화.

프로그램 3

유전자 RNAi 미끼의 세포주를 실험 재료로 사용합니다.

1. 경쇄 및 중쇄 아미노산을 이용하여 RNAi 미끼 유전자의 세포주 및 대조군 세포주를 5~6세대 배양한 후 단백질을 추출한다.

2. 전체 세포 단백질의 경쇄, 중쇄를 추출하고 단백질 미끼에 대한 특정 항체를 사용하여 IP를 생성합니다.

3. 경쇄 및 중쇄 단백질의 IP 생성물을 섞은 후 SDS-PAGE로 분리합니다.

4. 플라스틱 내부 소화, 펩타이드 추출, 정제, 식별 및 정량화.

SILAC 사용의 장점

기존의 CoIP 또는 풀다운과 비교했을 때, SILAC은 강력한 특이성, 낮은 거짓 양성 극, 높은 처리량, LC-MS 및 큰 한계를 가지고 있으며, 미끼 단백질과 상호 작용할 수 있는 다른 단백질의 상대적 함량을 검출합니다. 게다가, 시험관 표지 기술과 비교했을 때, SILAC은 수천 개의 단백질을 정확하게 검출하고 정량화할 수 있으며, 더 적은 단백질 샘플이 필요합니다. SILAC은 세포 기능에 영향을 미치지 않는 생체 표지 기술입니다. 따라서 SILAC 프로테오믹스 분석 분야에서 널리 사용되고 환영받고 있습니다.